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새로운 유전체 편집 기술이 실험실 생물안전에 미치는 영향 고찰
  • 작성일2017-08-31
  • 최종수정일2017-08-31
  • 담당부서생물안전평가과
  • 연락처043-719-8053
  • 3,990
새로운 유전체 편집 기술이 실험실 생물안전에 미치는 영향 고찰

질병관리본부 국립보건연구원 생물안전평가과
유민수, 신행섭, 강연호*
국립안동대학교 생명과학과
임재환
*교신저자: slowpc@korea.kr, 043-719-8040

  Abstract

A systematic review for the effect of emerging genome editing technology on laboratory biosafety

Yu minsu, Shin Haeng-Seop, Kang Yeon-Ho
Division of Biosafety Evaluation and Control, KNIH, KCDC
Lim Jae-Hwan
Department of biological science, Andong National University, South Korea

Background: Genome editing technology is a powerful tool for rewriting DNA sequences in all organisms. This technology is generally used in gene functional research, development of high value-added plant or animal models, and treatment of rare refractory diseases. It is the principle of modifying the characteristics of genes by cutting or repairing specific region in a gene.
Current status: Genome editing technology are divided into four generations depending on the types of nucleic acid digestion enzyme and gene targeting methods. Despite the advances in technology, there are still problems to solve such as off-target effect. Although genome editing technology is not inherently dangerous, it can increase exposure times and exposure concentrations due to inexpensive and easy testing methods. This may cause adverse effects and/or increase the number of risk factors such as off-target effect and alteration of expression profiles.
Future perspectives: A novel approach strategy for the safety of new recombinant technologies should be developed to ensure systematic laboratory biosafety with technical measures. Since the approach strategies applicable to each case vary, it is also necessary to study the standardization and improvement of the existing risk assessment systems such as the introduction of risk assessment factors on unintentional exposure and potential risks. 


  들어가는 말


유전자가위로 대표되는 유전체 편집 기술(genome editing technology)은 모든 생명체의 DNA 염기서열을 고쳐 쓸 수 있는 강력한 도구다. 기본적으로 원하는 유전자를 절단하고 수선하는 메커니즘을 통해 원하는 특성을 삭제하거나 추가하는 도구로서 일반적으로 유전자 기능 연구, 고부가가치 유전자 변형 동‧식물 개발, 유전병 및 난치성 질환 치료에 이용된다.
하지만 유전자가위 기술의 상용화에 있어 안전성 문제와 생명윤리 등의 논란이 지속적으로 제기되고 있다. 가장 큰 문제는 원하는 유전자를 정확히 제거할 수 있는지 측정할 방법이 없어, 유전자가위가 표적 유전자의 염기서열과 유사한 염기서열에도 변이를 일으킬 가능성(off-target effect, 이하 오프타겟 효과)이 있다는 점이다. 이러한 오프타겟 효과는 환자의 생명 등 안전에 영향을 미칠 수 있다는 점에서 유전체 편집 기술의 안전성에 대한 논란의 원인으로 지목되고 있으며[1] 실험실에서 유전체 편집 기술을 이용할 경우 의도적으로 치료제/소독제 내성 병원체를 손쉽게 개발하거나 의도하지 않은 병원성을 가진 유전자 변형 생물체(Living modified organism, LMO)를 만들어냄으로써, 실험실 유래 생물안전사고의 발생 가능성이 증가될 수 있다.
따라서 본 글에서는 새로이 등장한 유전자가위 기술의 특성을 설명하고, 해당 기술에 의해 발생 가능한 실험실 생물안전 사항을 고찰하여 이의 대응방향에 대해 논의하고자 하였다.


  몸 말


유전자가위는 targeting(이하 유전자적중), cutting(이하 절단), repair(이하 복구)의 3단계로 기능한다.
유전자적중은 유전자가위가 원하는 염기서열에만 선택적으로 달라붙는 단계로, 유전자 선택에 단백질을 이용한 1세대 및 2세대 기술과 RNA를 이용하는 3세대 기술로 구분한다. 절단은 제한효소와 비슷한 핵산분해효소에 의해 이루어지지만 특정 조건을 만족한다면 어디든지 원하는 위치를 자를 수 있다는 점이 다르다. 다만 복구는 세포의 자체적인 회복기작에 따라 이루어진다.
유전자가위가 DNA를 특이적으로 절단하면 이중가닥 절단(double strand break, DSB)이 생기게 된다. 이때 세포는 피해를 최소화하기 위해 내재적 복구 기작을 이용하여 잘린 DNA를 다시 붙인다. 복구의 메커니즘은 오류가 일어나기 쉬운 비상동재조합(non-homologous end joining, NHEJ) 경로와 정교하게 수선되는 상동 인도 복구(homologous directed repair, HDR) 경로를 따른다.
NHEJ는 주형(template) 없이 이어붙이는 효율적인 기작이지만 절단부위에 돌연변이를 일으켜 유전자의 기능을 침묵(silencing) 시킬 수 있는데, 이 특성을 이용해 유전자 기능 연구 또는 질병의 매개체 또는 원인을 제거하는 유전자 교정에 사용한다. HDR은 세포내 상동염색체나 유사한 외부 DNA를 주형으로 이용하여 정교하게 수선하는 기작으로, 주형 유전자를 사용한 돌연변이를 유도할 수 있다는 점에서 새로운 유전체를 집어넣는데 이용되거나 유전자 치료용 기술로 활용된다. 하지만 HDR의 효율은 NHEJ에 비해 낮은 편이다.

1. 유전자가위 기술의 메커니즘과 이용형태


지금까지 개발된 유전자가위 기술은 핵산분해효소와 유전자적중 방식에 따라 총 3세대까지 구분한다. 1세대 유전자가위인 ZFN(zinc finger nuclease), 2세대 유전자가위인 TALEN(tranion activator-like effector nuclease)은 절단을 위한 핵산분해효소인 FokI과 유전자적중에 이용되는 단백질을 연결한 단백질 기반 도구이다. ZFN은 유전자적중에 zinc finger motif를 DNA와 결합하는 도메인으로 사용하고, TALEN은 식물병원체(Xanthomonas spp.)의 TAL effector 단백질을 DNA 결합 도메인으로 사용한다(Figure 1).
ZFN과 TALEN은 기존의 유전자 변이를 일으키는 방법에 비해 특이성과 효율성에서 장점이 있어 세포 수준뿐만 아니라 다양한 동식물의 DNA 변이를 일으키는데 이용되었지만 표적 DNA가 달라질 때마다 단백질을 변형시켜야 하는 어려움이 있어 비용과 시간이 많이 들며, 취급이 어렵다는 단점을 갖고 있다. 특히 ZFN은 유전자적중에 이용되는 인식부위가 짧아(9~18 bp) 비의도적인 오프타겟 효과를 일으킨다는 점에서 안전성도 낮은 편이다. 이에 비해 TALEN은 인식부위가 상대적으로 길고(14~20 bp), 단백질 기반으로 결합하기에 특이성이 높아 오프타겟 효과가 거의 일어나지 않는다는 장점이 있다.
3세대 유전자가위인 CRISPR/Cas9는 1세대와 2세대에 비해 구현되는 메커니즘이 완전히 다르다. CRISPR은 1987년 일본의 요구르트 회사에서 산업적으로 이용되는 유산균에 감염되는 파지(phage)를 연구하다가, 원핵생물체에 짧은 반복 염기서열이 유사하게 존재하는 것을 확인함으로써 발견되었다. 이후 이 염기서열에 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)이라는 이름이 붙여졌고, 2007년 CRISPR은 박테리아가 외부 침입에 대응하는 면역체계의 일부로 확인되었다(Figure 2).
인간의 면역체계와 유사하게, 박테리아 또한 외부에서 유전자가 침입해 오면 이를 분해하고 파괴하는 면역체계를 갖고 있다. 박테리아는 파괴한 외부 유전자의 일부분을 잘라 유전체에 저장해 두었다가, 다시 침입해 올 경우 발현시켜 즉각 대응하는데 이것이 박테리아의 면역체계인 CRISPR 시스템이다.
3세대 유전자가위인 CRISPR/Cas9은 화농성 포도알균(Staphylococcus pyogenes)의 면역체계를 이용해 침입유전자 정보저장에 이용되는 crRNA를 유전자적중 도구인 sgRNA로 활용하고, 유전자를 절단하는 핵산분해효소인 Cas9 단백질과 함께 이를 가동시키는 tracRNA를 연결한 것이다(Figure 2). 이러한 CRISPR/Cas9은 DNA의 20 bp를 절단부위로 인식하므로 이론상 TALEN처럼 특이성이 높아야 한다. 그러나 실제로 인체에서 4중 내지 6중의 오프타겟 효과의 가능성이 보고된 바 있다[2].
그 외로 CRISPR/Cpf1은 CRISPR/Cas9에 비해 두 가지의 큰 차이가 있다. 먼저 핵산분해효소로 Prevotella 속 및 Francisella 속의 Cpf1을 사용하면서 tracRNA가 이용되지 않는다. 또한 Cpf1 또한 Cas9에 비해 작으며 인식을 위한 필수부위도 다르고 절단부위 또한 직선으로 절단하는 Cas9에 비해 5 nucleotide의 차이가 나도록 어긋나게 잘리므로 이용과 편집이 용이하다(Figure 3).

2. 오프타겟 효과와 발현 양상(expression profile)

오프타겟 효과는 본래 독성학이나 화학물질 위해성 평가에서 사용되는 용어로, 생명공학에서는 원하는 DNA염기서열과 비슷하지만 원하지 않은 다른 곳에서 DNA를 절단하는 현상을 의미한다. 이는 생명체의 유전자가 원하지 않는 부위에 손상을 입는다는 뜻이다[4].
생명공학에서 오프타겟 효과에 대한 논의가 활성화된 계기는 2002년 등장한 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 이용한 유전자재조합의 위해논란이었다. RNAi는 21~25 bp의 이중가닥 RNA가 상보적인 서열을 가지는 mRNA와 결합하여 분해됨으로써, 세포 내 기능과 유전자의 발현을 억제한다. 이러한 RNAi는 매우 서열 특이적인 현상이지만, 생체 내에서는 몇 개의 서열 불일치가 있다 하더라도 RISC(RNA induced silencing complex)와 작은 리보핵산의 복합체가 mRNA를 인지하여 분해할 수 있으므로 원하지 않은 다른 곳에서 유전자의 발현이나 세포의 발달 억제, 세포 생존율 저하[5] 등의 오프타겟 효과가 다양하게 발생하였다[6].
이러한 오프타겟 효과는 RNAi를 이용하려는 연구자들에게 오랫동안 큰 문제가 되어왔다. 오프타겟 효과 발생빈도는 siRNA의 양 및 구조에 따라 결정되는 경향이 있으므로, 오프타겟 효과 발생빈도를 감소시키기 위해 RNAi의 설계를 최적화하는 연구가 활발하게 진행 중에 있다. 그 외에도 mRNA와 단백질의 안정성 및 세포 내 위치, RNAi machinery protein들의 상태, 다양한 유전적 보상기전(genetic compensation mechanisms) 등 아직 설명할 수 없는 여러 요소들에 의해 RNAi 효율이 결정되며, 필수적으로 수행되는 과정인 RNA/DNA 형질주입(transfection) 또는 바이러스성 감염(viral infection) 과정에서 발생되는 세포의 스트레스 및 손상에 의한 발현 양상(expression profile)의 변화 또한 RNAi의 문제점으로 제시되고 있다[7].
RNAi와 마찬가지로 유전자가위 또한 비특이적인 곳에서 이중가닥 절단이 일어나면 해당 지역에 돌연변이가 생성될 가능성이 매우 높아진다. 이러한 비특이적인 돌연변이는 해당 세포를 사멸하게 하거나 그 기능을 변질시킬 수 있는데, 비특이적 절단이 일어날 가능성은 유전자가위가 세포 내에 발현되는 시간이 길어질수록 증가한다[8, 9]. 때문에 기본적으로 sgRNA를 최적화함으로써 오프타겟 효과를 저감하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으며[10], 그 외로 유전자가위를 되도록 짧은 시간 동안 발현하도록 하는 등 유전자가위의 부작용을 줄일 수 있는 여러 방안이 제시되고 있다[4].
이와 같이 유전자가위로 인해 발생할 수 있는 오프타겟 효과의 발생 가능성과 이에 대한 대응방법의 연구는 RNA 간섭기술의 형태와 매우 닮아있다. 3세대 유전자가위와 또한 RNA를 기반으로 하는 sgRNA를 이용함으로 RNAi 기술이 가진 오프타겟 효과와 발현 양상의 변화문제가 동일하게 나타나는 것으로 추정된다.
따라서 유전자 편집기술의 문제점인 오프타겟 효과의 해결을 위해서는 유전자적중의 특이성(specificity)을 높이거나, 오프타겟 돌연변이를 손쉽게 확인 할 수 있는 방법이 개발되어야 하며, 유전체 편집기술의 안전성은 오프타겟 효과 빈도를 결정하는 유전자적중의 특이성에 따라 결정된다고 할 수 있다. 3세대 기술인 CRISPR은 2세대 기술인 TALEN과 비교했을 때 세포독성(cytotoxicity) 등 안전성이 낮다고 평가되는 것도 이 때문이다(Figure 4).

3. 해외의 신규 생명공학기술과 인체 위해성 평가

최근 바이오안전성의정서에는 이전의 유전자 변형 생물체의 안정성 및 인체 위해성을 평가하기 위하여 직접적(targeted) 및 간접적(semi-targeted) 그리고 비의도적인(un-targeted) 변이를 구분하고 이들의 분석을 위한 최근의 기술을 아래의 표(Table 1)와 같이 제시하고 있다. 이에 따라 인체 위해성 평가체계의 수정이 필요하다. 특히 유전자가위 등 신기술에 의해 개발된 유전자 변형 생물체의 위해성 심사에서 적용되는 의사결정체계는 보건복지부, 식품의약품안전처, 미래창조과학부 등 관련 부처별로 일부 상이한 부분이 존재하므로, 국제적인 기준이 반영된 공통된 원칙의 마련이 필요할 것으로 사료된다.
EU는 2012년부터 신규 육종 기술들을 활용해 개발되고 있는 작물들에 대한 위해성 평가기준을 마련하고 있으며 2014년 이후 각종 포럼을 통하여 환경 위해성 부분에 관한 평가 지표 및 규제방안 등에 대한 논의를 진행하고 있다.
또한 미국 농무부는 게놈 편집 식물이 외래 DNA를 가지고 있지 않은 경우 등이라면 유전자 변형이 아니라고 판단하고 있으며 많은 경우의 게놈 편집이 이 경우에 해당할 수 있다. 반면에 EU는 자연적인 짝짓기나 재조합이 아닌 방식으로 변경한 경우 생물체는 유전자 변형으로 간주하고 있으며 더불어서 자연 상태에 존재하지 않는 형태의 서열을 가지는 게놈 편집 식물을 대체로 유전자변형체(genetically modified organism, GMO)라고 판단하고 있다. 위에서 보듯이 각국은 그 이해관계에 따라 신규 기술을 적용한 유전자 편집 생물체의 GMO 판단이 각각 다르며 현재까지의 유럽법과 국제법에서는 유전자 편집된 생물은 GMO의 정의에 속하는 것으로 판단된다(Table 2).
유전자 편집 기술은 전통적인 유전공학 기법보다 더 정확하지만, 새롭게 생성된 식물 등에 비의도적으로 예기치 않은 영향이나 예측할 수 없는 영향을 줄 가능성이 여전히 존재하며 현재 상업적 유전자 변형(genetically modified, GM) 작물은 개발기관들이 예상치 못한 효과를 초래할 수 있다는 것과 식품 안전 및 환경에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 RNAi 기술, 유전자 편집기술, NBT 기술 등을 포함하는 신기술을 활용한 유전자 발현 변형 생물체의 GMO 판단을 위해서는 공청회 등을 통한 사회적 논의가 선행되어야 하며, 이를 위하여 신기술을 이용하여 개발된 유전자 변형 생물체의 인체 위해성의 판단에 대한 표준화 과제를 추진하여야 할 것으로 사료된다.

4. 유전자가위 기술과 실험실 생물안전


유전자가위 기술이 실제 실험에 이용되는 형태는 크게 네 가지로 구분될 수 있다. 일반적인 이용방법인 플라스미드(plasmid)에 CRISPR 카세트를 넣어 세포주에 직접적으로 전달하는 방법, in vitro에서 전사(transcribed)시킨 sgRNA와 정제된 핵산분해효소를 수정란에 미량 주사하는 방법(microinjection), 체세포 변이를 위해 높은 역가(titer)를 가지는 바이러스성 벡터에 CRISPR을 넣고 조직이나 세포에 도입하는 방법, 마지막으로 가이드 라이브러리를 제작해 바이러스성 벡터에 삽입하여 유전체 수준의 기능선별방법(genome-scale functional screening)이 있다(Figure 5).
실험실 수준에서 유전자가위 기술 자체가 가지는 특성과 취급방법을 고려할 때, 해당 기술에 의한 오프타겟 효과와 발현 양상에 의한 위해 수준은 기존의 유전자재조합 기법에 비해 크지 않다. 그러나 기존의 유전자재조합 기법과 비교했을 때 유전자가위 기술이 가지는 가장 큰 차이점은 바로 저렴한 비용과 실험의 용이성이다.
고가의 장비나 훈련을 통한 수련이 필요했던 기존의 기술과 비교했을 때 유전자가위 기술은 매우 강력한 접근성을 가진다. 따라서 매우 다양한 유전자재조합이 다량으로 진행될 수 있으며 다른 유전자재조합 기술, 특히 하나의 종을 사멸시키는 유전자 드라이브(gene drive) 기술과 함께 이용할 경우 발생 가능한 위해성을 고려해야 한다.
위해성이란 발생 가능성(likelihood)과 심각성(consequence)의 곱셈으로 계산되며, 이를 위해 노출 가능성과 노출량, 용량-반응평가를 통해 평가된다(Figure 6). 유전자가위 기술은 노출 가능성과 노출량을 증가시키는 유전자재조합 기술이며, 오프타겟 효과와 발현 양상은 위해요인의 수를 증가시킨다. 특히 유전자가위 sgRNA의 설계오류는 오프타겟 효과와 발현 양상을 발생시키는 원인이므로, 적절한 실험 설계 및 실험 종사자에 대한 충분한 생물안전교육과 철저한 생물자원의 취급관리로 실험실에서 시작되는 생물위해가 발생하지 않도록 사전에 대응할 필요가 있다.


  맺는 말


신종감염병의 발생과 확산이 증가함에 따라 백신 개발 등을 위한 고위험병원체의 취급 수요가 증가하였으며, 이에 따라 유전자재조합 실험도 함께 증가하고 있다. 이에 연구시설의 생물학적 사고 및 의도적 생물테러 발생으로 인한 질병 대유행 발생에 대한 우려가 제기되고 있다.
예를 들어 2003년 싱가포르[21]와 대만[22]에서 발생한 SARS virus의 실험실 획득감염 사고, 2014년 US CDC에서 보관 중이던 탄저균 노출사고와 조류독감 균주의 운송사고[23], 2014년 US FDA 메릴랜드 베데스다 연구시설에서 발생한 Smallpox 등 인체 위해성이 높은 감염성 병원체 재고관리 실패[3] 및 2015년 미국 국방성의 탄저균 배송사고[24] 등의 사례는 이러한 우려에 설득력을 더하고 있다.
미국의 실험실에서 잠재적인 대유행 병원체(potential pandemic pathogens, PPPs)가 유출될 발생 가능성(likelihood)은 80%로 추정되며[25], 심각성(consequence)은 지난 10년간 5%에서 27%로 증가하였다고 측정됨에 따라[26], 실험실 유래 대유행 위해성은 21.6%로 계산된다.
유전자가위 기술은 저렴하고 사용이 편리하여 GM 바이러스 병원체의 발생을 증가시키므로 이러한 GM 병원체가 유출될 발생 가능성(likelihood) 또한 증가시킨다. 또한 유전자가위 기술은 유전체의 편집을 용이하게 하므로 의도적/비의도적인 바이러스 유전체 변형빈도를 증가시키며 이 과정에서 기존 치료제/백신 등에 내성을 가질 가능성이 증가한다. 실제로 바이러스 염색체에서 1개 혹은 2개의 염기서열에 돌연변이가 일어날 경우 해당 돌연변이 바이러스는 치료제나 약제에 내성을 갖게 된다.
결과적으로 의도적/비의도적으로 유전체가 편집된 LM 바이러스 병원체는 치료제에 내성 또는 pathogenesis 관련 유전자에 변형이 이루어질 가능성이 증가하여 심각성(consequence) 또한 증가시킨다. 따라서 유전자가위 기술은 바이러스성 병원체의 발생 가능성과 심각성을 크게 증가시켜 위해도를 높이므로, 실험실 유래 대유행 가능성을 증가시킬 수 있는 기술이라 사료된다. 따라서 유전자재조합 기술의 안전을 확보하기 위한 기술적 조치와 함께 체계적인 실험실 생물안전을 확보할 수 있는 전략적 접근방법이 개발되어야 한다. 다만 사례별로 그 적용은 차이가 있을 수 있으므로, 비의도적인 노출과 잠재적 위해성에 관한 위해성 평가 요소의 적용은 필수적이다. 이를 위해 위해성 심사 시 비의도적인 노출과 잠재적 위해성에 관한 위해성 평가 요소의 도입 등 현행 위해성 평가체계의 개선 및 평가기술 표준화연구가 필요하다고 판단된다.

이 글은 2016년 국립안동대학교가 수행한 질병관리본부의 학술연구 용역과제 결과보고서인 “유전자가위(CRISPR) 등 새로운 유전자 변형 생물체 개발 기술에 대한 인체 위해성 평가기준 개발 연구”의 일부를 요약 후 세부사항을 추가 및 보완하여 정리한 것입니다.


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