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단백체 기반 데이터베이스 확보를 통한 병원체자원 동정 고도화
  • 작성일2017-08-03
  • 최종수정일2021-04-15
  • 담당부서병원체자원관리TF
  • 연락처043-719-6876
  • 3,131
단백체 기반 데이터베이스 확보를 통한 병원체자원 동정 고도화

질병관리본부 감염병연구센터 병원체자원관리TF
유원선, 이경민, 황규잠*
*교신저자: kyuhwang61@korea.kr, 043-719-6870

  Abstract

Improved identification for pathogen resources using MALDI-TOF MS

Yu Won-Seon, Lee Kyeong-Min and Hwang Kyu-Jam
Pathogen Resource Management TF, Center for Infectious Disease Research, KCDC

Although pathogens are threats to public health as causative agents of infectious diseases, a recent trend is emerging where "pathogen resources" are being recognized as important elements for enabling research and development in the biotechnology industry. Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a method of measuring the constituent material based on the time it takes to ionize and reach the detector in a vacuum tube. Up to now, 100 proteome-based MS profiles has been obtained using MALDI-TOF MS, producing a database of clinical isolate pathogen resources in Korea. It is expected that this project will contribute to the improvement in the identification rate through continual addition to a proteome-based database.


세균, 바이러스, 진균 등과 같은 병원체자원은 인간에게 질병을 일으키는 위험성을 동반하면서 한편으로는 백신 후보주의 개발, 진단 마커의 탐색, 관련 질병기전 연구 등에 귀중한 자원으로 활용될 수 있는 잠재적 가치성을 보유하고 있다[1]. 생물다양성협약(Convention on Biological Diversity)의 부속 협약에 따른 유전자원 접근 및 이익 공유에 관한 나고야 의정서(Nagoya Protocol)가 2014년에 발효된 후 생물자원으로써 병원체 자원의 가치가 높아지고 있다. 이를 근거로 다른 나라의 병원체자원을 이용하여 진단제, 백신, 치료제 등을 개발할 경우 그 소유권과 이익을 제공한 나라와 공유해야 된다. 따라서 세계 각국은 자국의 병원체자원에 대한 주권 확보에 주력하고 있으며 국가 간 병원체자원의 이동 또한 제한하고 있다[2]. 질병관리본부 국립보건연구원 병원체자원관리TF에서는 국가병원체자원은행(National Culture Collection for Pathogens; NCCP, http://nccp.kdca.go.kr)의 운영을 통하여 인체에 감염을 일으키는 병원성 미생물을 국가차원에서 수집하고 자원화하여 이를 질병의 예방, 진단, 백신 및 신약 개발 등을 수행하는 보건의료 연구자들에게 제공하고 있다. 국가병원체자원은행은 국제사회 변화에 대처하고자 지난 2017년 2월4일에 병원체자원의 수집, 관리 및 활용 촉진에 관한 법률을 시행하는 등 병원체자원관리의 역량을 강화하고 있다[3].
병원체자원을 보존 관리함에 있어 미생물 동정은 병원체의 특성을 구분하는데 기본이 되는 매우 중요한 항목이다. 현미경을 이용한 형태학적 특성과 생화학적 특성을 이용한 전통적인 미생물 동정법은 시간이 많이 소요되고, 실험자의 숙련도에 따라 결과의 판정에 오류가 다소 발생할 수 있다는 단점이 있다. 이러한 문제를 해결하고자 지방산의 비율을 분석하는 Microbial Identification System(MIDI, Inc., Wilmington, North Carolina, USA), 생화학적 특성을 이용한 VITEK2(BioMeriux, Inc., Marcy_l’Eltoile, France), 그리고 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight(MALDI-TOF) 질량분석기(Bruker Daltonics, Inc., Bremen, Germany) 등 미생물 자동화 동정기기가 개발되어 연구 및 산업적인 곳에 널리 활용되고 있다. 특히 이러한 자동화 동정시스템들은 분석에 상대적으로 시간이 걸리는 16S rRNA의 계통진화분석과 비교하여 다수의 균주를 신속하고 간편하게 분석할 수 있다는 장점이 있으며, 미생물의 생화학적 분석 결과를 기존에 연구된 결과와 비교하여 결과를 판정하는데 시간 소요가 짧은 장점과 더불어 분석이 가능한 병원체가 한정되어있다는 한계도 갖고 있다[4].
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometer(MALDI-TOF MS)는 검체를 이온화하여 진공관에서 검출기에 도달하는 시간을 근거로 구성물질의 질량을 측정하는 방법이다. MALDI-TOF MS를 이용한 세균 및 진균의 동정방법과 분석원리에 대한 모식도는 다음과 같다(Figure 1).
MALDI-TOF MS를 이용한 미생물 동정의 일반적인 과정은 다음과 같다. 세균 및 진균의 집락 샘플을 MALDI plate에 점적한 후 matrix를 첨가하고 완전히 건조시킨다(Figure 1A). 혼합물이 올려진 plate를 진공조건을 만들어주면 유기용매는 기화되고 시료는 matrix와 함께 균질하게 결정화된다. 이때 laser를 조사하면 에너지가 matrix를 통해 샘플로 전달되어 약한 이온화가 발생한다. 전기장을 사용하여 이온들을 질량 대 전하비(mass-to-charge ratio, m/z)에 따라 분리시킨 후, MS 소프트웨어를 사용하여 분석해 MS profile을 생성한다. 이 프로파일은 질량 대 전하비(mass-to-charge ratio, m/z; X축)에 대한 폴리펩타이드의 양(intensity value; y축)에 해당하는 점으로 표시한다(Figure 1B). 생성된 단백체 프로파일은 내재되어 있는 참조 스펙트럼 데이터베이스의 스펙트럼과 샘플의 단백체 프로파일 패턴을 비교하는 핑커 프린팅 방법을 적용하여 미생물 동정 결과를 얻는다. 최근 개발된 MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)은 MALDI-TOF MS 기법을 이용하여 얻은 세균의 단백질 정보를 이미 구축된 각 균종의 정보와 비교 분석하여 균종을 동정하는 방법이다[5, 6].
MALDI-TOF MS는 균체에서의 단백 발현에 대한 대표 프로파일을 만들 수 있어 다양한 바이오마커 개발 연구에 사용되고 있다. 또한 MALDI-TOF MS의 장점은 특정 기술이나 비싼 시약의 사용 없이 최소 시간 내에 미확인 세균 집락을 동정 할 수 있다는 점이다. Seng 등(2009)의 연구에 의하면 MALDI-TOF MS 동정 시간은 균주 당 평균 6분이며, 산출된 동정 비용은 상품화 키트를 포함한 전통적 동정 방법의 22~32%로 미생물 실험실에서 이용하기에 간편하고 동정에 소요되는 시간이 매우 짧으며 소모비용이 적음을 제시하였다[7]. MALDI-TOF MS분석은 일반 실험실에서의 분자유전학적 방법과 비교했을 때 시간을 크게 단축시켜주기 때문에 미생물 동정에 있어서 진일보된 동정방법으로서의 잠재력을 가지고 있다. MALDI-TOF MS의 대표적인 분석소프트웨어인 SARAMIS(BioMeriux, Inc., Marcy_l’Eltoile, France)나 Biotyper(Bruker Daltonics Inc., Bremen, Germany)는 세균동정에서 매우 뛰어난 기능을 보이는 것으로 보고되고 있다. 그러나 각 균주별 특성을 단백질 수준으로만 비교하여 구분하는 것에는 제한이 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 다양한 임상분리주의 수집을 통하여 대표 프로파일을 확보하고 이에 대한 단백체 데이터베이스를 강화하여 16S rRNA 유전자 염기서열분석 및 전통적인 생화학적 분석만으로 동정하기 어려운 세균의 동정과 관련된 보고가 증가하고 있다. Benagli(2012) 및 Lista(2011) 등은 Aeromonas 속, Brucella 속의 균주 간 유전자적 상관관계에 근거하여 종 동정이 가능한 참조 라이브러리를 만들었다고 보고하였다[8, 9]. 또한 세균 및 진균과 다르게 바이러스 동정에 MALDI-TOF MS를 사용한 보고는 없었으나 최근에 바이러스 단백체 프로파일을 확보하여 바이러스에 감염된 세포와 비감염세포를 구분하는 실험에 활용한 보고가 있었다[10].
병원체자원관리TF에서는 병원체자원 동정 및 특성 확인 방법으로 MALDI-TOF MS를 사용하고 있다. 국가병원체자원은행에 등록되어있는 병원체자원 중 Bacillus, Escherichia 속 6종 100주에 대한 단백체 프로파일 100건을 확보하였다. 5종의 Bacillus, E. coli 균종의 대표적인 단백체 프로파일은 다음과 같다(Figure 2).
확보된 단백체 프로파일을 이용하여 국내 임상분리 병원체자원 데이터베이스를 제작하였고 단백체 프로파일기반 major spectrum profile(MSP) 계통도를 제작하여 Bacillus strain간의 상관관계를 확인한 결과 각각의 종들은 단일 계통군에 속하는 것을 확인하였다(Figure 3). 향후 유전자기반 DNA 핑거프린팅 방법과의 비교분석을 수행하고 병원체자원 동정과 특성 확인에 활용할 수 있는 신규 분자지표 탐색을 진행할 예정이다. 이 연구를 통하여 국내 임상분리 병원체자원의 단백체 기반 데이터베이스를 지속적으로 확보함으로써 병원체자원 동정 및 분석기술 향상에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대하고 있다.


  참고문헌

1. 유원선, 이경민, 황규잠. 자동화동정시스템으로 미동정된 인체유래 병원체의 자원화. 주간 건강과 질병. 2015;8(42): 990-7.
2. Greiber T, Moreno SP, Ahren M et al. 2012. An explanatory guide to the Nagoya Protocol on access and benefit-sharing. ICUN.
3. 송수진, 이경민, 황규잠. 국가 병원체자원의 수집, 관리 및 활용 촉진을 위한 법률 제정의 필요성. 주간 건강과 질병. 2015;8(45): 1068-71.
4. Funke G, Monnet D, Bernardis C, von Graevenitz A, Freney J. Evaluation of the VITEK 2 system for rapid identification of medically relevant gram-negative rods. J Clin Microbiol. 1998;36, 1948-52.
5. Clark AE, Kaleta EJ, Arota A, Wolk DM. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry: a Fundamntal Shift in the Routine Practice of Clinical Microbiology. Clinical Microbiology Reviews. 2013;26(3): 547-603.
6. Yu WS, Lee KM, Hwang KJ. Taxonomic Identification of Bacillus Species Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. Ann Clin Microbiol. 2016;19(4): 110-9.
7. Seng P, Drancourt M, Gouriet F, Fournier PE, Rolain JM, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 2009;49: 543-51.
8. Benagli C, Demarta A, Caminada AP, Ziegler D, Petrini O, Tonolla M. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. PLoS One. 2012;7, e48441.
9. Lista F, Reubsaet FA, De Santis, Parchen RR, Kieboom J et al. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS. BMC Microbiol. 2011;11(December (1)), 267.
10. Calderaro A, Arcangeletti MC, Rodighiero I, Buttrini M, Montecchini S, Simone RV et al. Identification of different respiratory viruses, after a cell culture step, by matrix assisted laser desorption/isonization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Sci Rep. 2016;27(6):36082.
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