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유전자 마커를 이용한 생물테러병원체 검출 기술 동향
  • 작성일2016-08-18
  • 최종수정일2016-08-18
  • 담당부서병원체방어연구과
  • 연락처043-719-8270
  • 4,857

유전자 마커를 이용한 생물테러병원체 검출 기술 동향
질병관리본부 국립보건연구원 병원체방어연구과
조수경, 전정훈, 유재연, 이기은*
*교신저자: gerhie@korea.kr / 043-719-8270

제이에스바이오테크 윤현규†
†공동교신저자: yoon0908@naver.com / 010-8851-6559

Abstract
Bioterrorism Agent Detection System Using Genetic Markers
Division of High-risk Pathogen Research, NIH, CDC
Jo Soo-Kyeong, Chun Jeong-hoon, Yu Jae-Yeon, Rhie Gi-eun
JS Biotech
Yoon Hyun Kyu

Following bioterrorism using the mail containing anthrax spores in the USA in October 2001, the importance of guarding against this threat increased day by day. Bioterrorism agents may come in the form of bacteria, virus, and fungi. The toxic effects of these pathogenic microgarnisms can cause serious social and economic losses. In addition, as bioterrorism pathogens are easy to develop compared to other weapons of mass destruction, preparedness is absolutely necessary.
Bioterrorism is hard to detect in the early stage since symptoms appear much later after infection and it is not easy to distinguish that diseases are caused by bioterror or natural infection. Because of this, it is very important to detect and confirm the pathogen in the early stage to adopt preventive measures and treat exposed patients rapidly. Recently, a molecular biological test, which is able to quickly detect various causes of bioterrorism, has been developed and commercialized. This text introduces the various equipments to properly detect bioterrorism infection on site.


들어가는 말

2001년 10월 미국에서 발생한 탄저 우편물테러 이후 전 세계적으로 생물테러의 위협이 현실화 될 수 있다는 점에서 이에 대한 대비의 중요성이 나날이 증가되고 있다. 생물테러는 살아있는 박테리아나 바이러스, 곰팡이 그리고 이들이 분비하는 독소 등을 통해 다양하게 발생될 수 있으며, 검출이 어려워 이로 인한 심각한 사회적, 경제적 손실이 발생 될 수 있다. 또한, 생물테러병원체를 생산하거나 무기화하는 것이 다른 대량살상 무기를 개발하는 것에 비해 손쉽게 접근할 수 있어, 이에 대한 대비가 무엇보다 필요하다.
미국 NIAID의 분류에 따르면, 위해도에 따라 병원체를 카테고리 A, B, C로 구분하고 있다(Table 1). 카테고리 A에는 국가안보와 공공의 건강에 큰 위협이 될 수 있고, 사회적 혼란을 야기할 수 있는 병원체가 포함되고, 카테고리 B에는 전파속도는 중간정도로 쉽고, 사망률은 낮으나 진단능력과 질병감시가 필요한 병원체가, 카테고리 C에는 높은 이환율과 사망률로 건강에 영향을 미칠 가능성이 있는 신종 병원체가 포함된다.

우리나라에서는“감염병의 예방 및 관리에 대한 법률”제2조제19항에 고위험병원체 36종을 지정하여 관리하고 있으며, 특히 탄저균(Bacillus anthracis), 페스트균(Yersinia pestis), 야토균(Francisella tularensis), 두창바이러스(Variola virus), 보툴리눔독소(Clostridium botulinum toxin), 바이러스성출혈열(Viral hemorrhagic fever) 중 에볼라열, 라싸열, 마버그열을 생물테러감염병으로 지정하여 관리하고 있다.
병원체를 이용한 생물테러는 일정기간의 잠복기를 거쳐 증상이 나타나기 때문에 초기 감지가 쉽지 않고, 기존의 자연 발생적인 감염병과 구별이 쉽지 않으나 노출된 환자에 대한 예방과 치료 및 적절한 방역대응이 신속히 이루어질 수 있도록 병원체를 조기에 탐지하고 확인하는 것이 무엇보다 중요하다. 원인병원체 규명을 위한 실험실 진단기술은 미생물학적 방법과 유전학적 방법, 항체를 이용한 혈청학적 방법으로 구분되며, 유전학적 방법은 민감도, 편의성, 재현성 등으로 최근 많이 사용되고 있다. 여기서는 유전자를 마커로 이용한 생물테러병원체 검출기술에 대하여 소개하고자 한다.


몸 말

1. GeneXpert® real-time 시스템
Cepheid 사의 GeneXpert® real-time 시스템은 장착된 카트리지에서 샘플의 추출, 증폭, 검출 과정이 이루어지기 때문에 자동화가 가능하다. 카트리지의 구조는 핵산추출부와 PCR 증폭부분이 하나로 구성되어 있으며, 현재. 1, 2, 4, 16개의 카트리지가 동시에 장착이 가능한 모듈로 구성된 기기가 상용화되었다. 본 시스템을 이용하여 생물테러 원인병원체를 검출할 수 있는 Biothreat와 Ebola Assay kit가 개발되었다. Biothreat의 경우 30개 이상의 탄저균을 45분 이내 검출이 가능하며 Ebola Assay kit는 그 최소검출한계(LOD)가 불활화 바이러스의 경우 73 copies/mL (95% CI: 51-97 copies/mL), 감염력이 있는 바이러스의 경우 1 pfu/mL이다[1].

2. FilmArray 시스템
BioFire사 FilmArray 시스템은 동결 건조된 시약을 포함한 진공 플라스틱 파우치와 검출시스템으로 구성되어 있다. 파우치 내에서 시료의 추출, 증폭, 검출이 진행되어 Cepheid GeneXpert® system처럼 별도의 조작이 필요치 않아 사용에 편리하다. 샘플이 진공에 의해 주입되면 lysis 용액과 혼합된 후 추출 채널로 이동하게 되고, 핵산 추출이 완료되면 1차 PCR과 2차 PCR을 각각 진행하여 해당 병원체의 표적유전자 존재유무를 확인함으로써 정확한 감염원이 검출된다. 현재 탄저균을 포함하여 총 16종의 생물테러 원인체가 적용된 BioThreat Kits가 개발되었으며(Table 1), 탄저균, 야토균, 페스트균의 genomic DNA를 적용하여 평가한 연구에서 250 genome equivalents (GEs) 이하의 민감도를 보이는 것으로 확인되었다[2].

3. RAZOR EX BioDetection 시스템
현장에서 최대 12개의 시료를 동시에 검사 가능한 real-time PCR시스템으로, FilmArray 시스템과 마찬가지로 동결 건조된 시약을 포함한 진공 파우치가 장착되어 편리하고 신속하게 원인병원체를 검출할 수 있다. 기기에 부착된 화면을 통해 증폭곡선을 확인할 수 있어, 현장에서 탄저균, 양 브루셀라균, 보툴리눔독소A, 큐열균, 장출혈성대장균(O157), 야토균, 리신, 살모넬라균, 두창, 페스트균 등의 진단이 가능하다. 또한 공기 수집 장치(air collection devices)를 추가 장착할 경우 공기 중의 탄저균을 확인 할 수도 있다[3].

4. VerePLEX™ Biosystem
Microarray 기술을 이용한 병원체 검출시스템으로 현재 category A에 포함된 탄저균, 야토균, 페스트균, 두창바이러스를 검출할 수 있는 제품을 출시하고 있다. 추출된 핵산을 Lab-on-Chip에 적용하여 Multiplex PCR을 수행하고 증폭산물을 microarray에 집적된 탐침과 교잡화한 후 세척과정을 거쳐 스캔하여 결과를 확인한다. Verechip은 실리콘 히터, 온도센서, 25ul 용량의 PCR 모듈에 400개의 올리고 스팟을 집적할 수 있도록 되어 있으며, 각 병원체는 반응 당 125 copies를 검출할 수 있고, 이 모든 과정을 수행하기 위해 3시간 정도 소요된다.

5. ArrayTube (AT) 플랫폼
Microarray기술을 이용한 ArrayTube (AT) 플랫폼은 일반적으로 실험에 사용되는 microtube와 유사한 형태의 플라스틱 튜브 하단에 각 원인병원체에 특이적인 탐침을 집적하고 증폭산물과 교잡 후 precipitation staining을 통해 결과를 확인하는 방식이다. 본 검사 플랫폼은 핵산, 단백질 기반 분석 모두 적용이 가능하고, 형광표지가 아닌 colorimetric staining법이 사용되어 별도의 광학스캐너를 이용해 결과를 확인한다. 현재 category B에 포함된 브루셀라속 균, 버크홀데리아속 균, 큐열균 등의 검출 및 유전형 분석이 가능한 키트가 있다[4,5].

6. UltraFast LabChip Real-time PCR G2-4 시스템
나노바이오시스사의 UltraFast LabChip Real-time PCR G2-4 시스템은 현장현시 진단이 가능한 real-time PCR 기기로서 독자적으로 개발한 plastic chip 내 16개의 시료 적용이 가능하다. 40 cycles PCR 과정을 20분 이내에 수행할 수 있으며 하나의 channel 당 2개의 표적유전자 검출이 가능하도록 FAM, CY5 개의 형광필터로 구성되어있다. 기기의 총 무게가 5.5 kg으로 현장에서 병원체를 검출 할 수 있고 별도의 배터리 팩을 장착할 경우 전원 공급이 원활하지 않은 환경에서도 현장현시 진단이 가능하다. 현재 본 시스템을 이용하여 category B에 포함된 식품매개 또는 수인성 병원체인 장출혈성대장균, 살모넬라속 균, 콜레라균 등을 검출할 수 있는 키트가 개발되어 있다.


맺는 말

생물테러 사건현장에서는 일반적인 실험실 환경에서 수행하는 진단과 달리 실험환경이 더 열악하고 짧은 시간 내로 오염된 검체에서 세균이나 바이러스 등 원인병원체를 확인해야 하므로 다수의 병원체를 동시에 검출할 수 있어야 하며, 비전문가도 손쉽게 사용할 수 있는 검출시스템이 주류를 이루고 있다. 이미 상용화된 검출시스템은 기본적으로 다중검사가 가능하고 실험실 진단장비와 비교하였을 때 상대적으로 무게가 가벼운 이동형 시스템이 많이 보급되고 있다.
기술적으로는 microarray와 real-time PCR 기술 기반으로 구분되며, Veredus laboratories VerePLEX™ Biosystem과 AlereTM ArrayTube 플랫폼이 microarry 기술을 Cepheid GeneXpert® system, Biofire FilmArray와 RAZOR EX, 나노바이오시스사의 UltraFast LabChip 시스템이 real-time PCR 기술을 적용하고 있다. 일부의 검출시스템은 모든 시약을 하나의 카트리지 또는 파우치에 담아 시료 주입만 실험자가 수행하면 유전자 추출과 증폭, 검출 등의 진행은 기기가 알아서 해주는 방식을 채택하고 있고, 일부는 유전자 추출과 증폭시 실험자의 간편한 조작을 필요로 한다. 앞서 소개한 검출시스템은 기기 성능에서는 큰 차이를 보이지 않지만 편의성이나 신속성, 가격적인 측면에서는 다소 부담스러운 검출시스템도 있다. 진단시스템의 기술적인 트렌드는 지속적으로 소형화되며 분석의 결과 또한 클라우드 시스템을 이용하여 공유되는 방향으로 개발되고 있어 앞으로는 특정장소에 한정되지 않고 이동성이 극대화된 hand-held 진단 시스템이 시장이 개발되어 보급될 것으로 보인다.
우리나라는 남북이 대치하고 있고, 북한은 다양한 종류의 생물테러 원인체를 보유하고 있다고 알려져 있어 무기화 등에 대한 철저한 대비가 필요하다는 점과 대도시에 인구가 밀집되어 있는 특성을 감안할 때 현장에서 바로 생물테러 원인체를 조기에 검출하는 진단기술이 필요한 실정이다. 이러한 점을 종합할 때 본 기고문에서 기술한 다양한 현장현시 진단시스템을 도입하거나 국내실정에 맞도록 새롭게 개발하여 국가차원에서의 효과적인 생물테러 대비가 필요한 것으로 사료된다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Benjamin A. Pinsky, Malaya K. Sahoo, Johanna Sandlund, Marika Kleman, Medha Kulkarni, Per Grufman, Malin Nygren, Robert Kwiatkowski, Ellen Jo Baron, Fred Tenover, Blake Denison, Russell Higuchi, Reuel Van Atta, Neil Reginald Beer, Alda Celena Carrillo, Pejman Naraghi-Arani, Chad E. Mire, Charlene Ranadheera, Allen Grolla, Nina Lagerqvist, David H. Persing ; Analytical Performance Characteristics of the Cepheid GeneXpert Ebola Assay for the Detection of Ebola Virus. PLoS ONE 10(11): e0142216. 2015
2. DR Seiner, HA Colburn, C Baird, RA Bartholomew, T Straub, K Victry, JR Hutchison, N Valentine, and CJ Bruckner-Lea ; Evaluation of the FilmArray® system for detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis. J Appl Microbiol. 114(4): 992–1000. 2013
3. Spaulding UK, Christensen CJ, Crisp RJ, Vaughn MB, Trauscht RC, Gardner JR, Thatcher SA, Clemens KM, Teng DH, Bird A, Ota IM, Hadfield T, Ryan V, Brunelle SL.; RAZOR EX anthrax air detection system. J AOAC Int. 95(3):860-91. 2012
4. Gernot Schmoock, Ralf Ehricht and Lisa D Sprague ; DNA microarray-based detection of Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever. Acta Veterinaria Scandinavica 56:27. 2014
5. Birgit Huelseweh, Ralf Ehricht and Hans-Juergen Marschall ; A simple and rapid protein array based method for the simultaneous detection of biowarfare agents. Proteomics 6, 2972–2981. 2006
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