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탄저균 바이오마커의 고감도 검출을 위한 현장진단용 바이오광센서 개발
  • 작성일2016-06-09
  • 최종수정일2016-06-09
  • 담당부서병원체방어연구과
  • 연락처043-719-8270
  • 3,552

탄저균 바이오마커의 고감도 검출을 위한 현장진단용 바이오광센서 개발
질병관리본부 국립보건연구원 병원체방어연구과
전준호, 이기은*
* 교신저자: gerhie@nih.go.kr / 043-719-8270
한양대학교 공학대학 생명나노공학과
고주희, 주재범†
† 공동교신저자: jbchoo@hanyang.ac.kr / 031-400-5201

Abstract
Fast and Sensitive Detection of an Anthrax Biomarker Using SERS-based Solenoid Microfluidic Sensor
Division of High-risk Pathogen Research, Center for Infectious Diseases, NIH, CDC
Jeon Jun Ho, Rhie Gi-eun
Department of Bionano Engineering, Hanyang University
Ko Juhui, Choo Jaebum

Background: Anthrax is an acute disease caused by the gram-positive bacterium Bacillus anthracis. Recently, it has been reported that the B. anthracis capsule is composed of poly-γ-D-glutamic acid (PGA), which is closely associated with the pathogenesis of the B. anthracis infection since it protects bacilli from immune surveillance. Consequently, the PGA capsule can be used as a target marker for the detection of B. anthracis.
Methods: We have developed a novel SERS-based magnetic sensor for highly sensitive detection of anthrax biomarker PGA in human serum. For fast, sensitive, and safe detection of such a hazardous material in human serum, we designed and fabricated a solenoid-embedded dual channel microfluidic device to perform the PGA immunoassay in an automated manner.
Results: Quantitative assays for eight different concentrations of PGA trace in serum were performed using the SERS-based microfluidic sensor. Here, PGA and PGA-conjugated AuNPs underwent competitive reaction with anti-PGA-immobilized magnetic beads in the microfluidic channel. Subsequently, magnetic immunocomplexes were trapped by yoke-type solenoids embedded in the channel, and their SERS signals were measured and analyzed. To improve the reliability for SERS measurements, the external standard values for PGA-free serum were measured using the control microfluidic channel. This greatly improved reliability by minimizing the influence of most experimental variables. The LOD determined by the SERS-based magnetic solenoid sensor was estimated to be 100 pg/mL. This low LOD value demonstrated that our SERS-based immunoassay was approximately three orders of magnitude more sensitive than corresponding ELISA-based methods. Accordingly, the proposed SERS-based magnetic solenoid microfluidic sensor technique, which possessed both high sensitivity and selectivity, showed significant potential for the safe, rapid and sensitive detection of hazardous materials in an automated manner.


I. 들어가는 말

생물학 무기는 저렴한 가격에 대량생산이 가능하고 쉽게 은닉하여 살포하는 것이 가능하여 미량으로도 막대한 피해를 발생시킬 수 있다. 또한 전염이 가능하기 때문에 테러를 인식하였을 때는 이미 넓은 지역으로 확산되어 다수의 사람들이 이미 감염된 후일 수 있다. 생물 테러의 피해를 최소화하기 위해서는 원인병원체를 신속하고 정확하게 탐지하는 것이 필요하다. 대표적인 예로, 고위험성 탄저균 (Bacillus anthracis)은 치명적인 인수공통 감염병인 탄저의 원인균으로 Tier1 select agent에 속하는 고위험 병원체이다 [1-3]. 최근, 탄저균의 외막을 둘러싸고 있는 Poly-γ-D-Glutamic Acid (PGA) 캡슐이 탄저균 검출을 위한 바이오마커로 활용될 수 있음이 보고되었다[4]. 기존에 개발된 생물학작용제 검출용 신속 탐지 키트는 휴대성과 현장 검사가 가능하다는 장점이 있지만 생물무기의 적정한 탐지 한계에 미달하는 측정민감도가 가장 큰 문제점으로 지적되어 왔으며, 이와 같은 기술적 한계를 해결하기 위해 신 개념 면역 분석 원리가 적용된 차세대 시스템 개발이 요구되고 있다.
표면증강라만산란 (SERS, Surface-enhanced Raman scattering)기반 검출 방법은 이러한 기존 키트의 검출 한계를 극복할 수 있는 분석법이다. 이 분석법은 라만 리포터 분자를 거친 금속 표면에 흡착하고 여기 광(레이저 광)을 주사하면, “hot junction”이라고 알려진 라만 리포터 분자의 SERS 활성 사이트에서 전자기적, 화학적 증강이 발생하여 라만 신호가 대폭 증폭된다[5-7]. 이 증폭 효과는 종래 라만 검출법이 가지는 단점인 저감도의 문제를 해결할 수 있으며, 종래의 화학발광분석법, 방사능 기반 면역분석법의 정확도와 검출 한계를 극복 할 수 있을 것으로 기대된다[8-10]. 본 연구에서는 이러한 원리를 이용하여 고위험성 탄저균을 고감도로 검출할 수 있는 미세유체칩 기반의 SERS 광센서를 설계하여 제작하였으며, 이를 이용하여 기존의 면역분석법보다 100-1,000 배 정도 검출한계를 향상시킬 수 있는 탄저균 마커의 고감도 검출용 바이오 광센서를 개발하였는데, 이에 대하여 간략하게 소개하고자 한다 [11,12].


II. 몸 말

1. 경쟁면역반응을 이용한 표면증강라만산란 기반의 탄저마커 탐지 기술 개발

탄저균을 탐지하기 위하여 탄저마커 항원 중의 하나인 PGA (poly-γ-D-glutamic acid) 인자와 특이적 결합성이 뛰어난 A-12 항체를 스크리닝 한 다음 이를 정제하여 추출하였다. 표면증강라만산란기술을 기반으로 한 탄저균 마커 항원의 검출을 위하여 Figure 1에 나타낸 바와 같이 PGA를 고정화한 금속 나노프로브와 이질 기능적(heterofunctional) 바이오링커를 이용하여 A-12항체를 고정화한 분리용 자성 마이크로 비드를 각각 합성하였다. 이때 합성된 A-12항체가 고정된 자성 마이크로 비드는 PEG (polyethylene glycol) 고분자를 이용하여 비드 표면을 코팅 처리함으로써 안정성이 증대되어 빠른 액상 반응 역학을 보이며, 정제와 분석에서 변동성을 낮추어 재현성 높은 결과를 확보할 수 있었다.
탄저균 마커 항원이 포함된 시료액(예: 환자의 혈액)에 마커 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 마이크로 자성 비드를 첨가하여 제 1면역반응을 수행하였다. 상기 시료액에 탄저균 마커 항원이 결합된 나노프로브를 첨가하여 경쟁적으로 제 2면역반응을 유도하였다. 반응이 완료된 후 자성 마이크로 비드를 제외한 여액에 레이저를 조사하여, 발생하는 SERS 신호를 측정하여 PGA의 유무와 정량적 분석 결과를 확인하였다(Figure 2).
표면증강 라만 산란 기반의 탄저마커 탐지 기술의 검출한계와 정량분석 가능성을 검증하기 위하여 기존 면역분석 방법인 ELISA 분석법을 이용하여 PGA의 면역분석 실험을 수행하였다. 먼저 7 개의 농도가 다른 PGA를 96 well plate에 각각 고정시킨 다음, 비특이 결합의 영향을 최소화하기 위하여 bovine serum albumin (BSA) 용액을 이용하여 남은 site들을 안정화하였다. 결합하지 않은 PGA 항원을 PBS 버퍼 용액으로 제거한 다음, excess 항체를 각 well에 넣고 반응시켰다. 반응 완료 후 각 well을 PBS 버퍼 용액으로 세척한 다음 peroxidase가 결합된 2차 항체를 반응시켰다. 최종 반응 완료 후 각 well을 PBS 버퍼 용액으로 세척하고 TMB 발색제 용액을 넣고 10분간 발색시킨 후 ELISA reader를 이용해 흡광도를 측정하였다. Figure 3은 PGA 항원에 대한 ELISA 정량실험 결과를 보여준다. ELISA 실험 결과, 측정 가능한 PGA 항원의 dynamic range는 200-1 μg/mL이며, 검출한계(limit of detection, LOD)는 100 ng/mL 이다. ELISA 기반 분석법은 오랜 반응 시간과 세척과정이 필요하며 검출감도가 비교적 낮은 반면, 경쟁반응을 이용한 표면증강라만산란 기반 탄저마커 탐지 기술은 기존보다 검출시간이 빠르고(10분 내외) 정량분석이 가능했으며, 신호증폭표지자인 나노프로브를 사용함으로써 고감도 분석이 가능하다.

2. 탄저 바이오마커 검출용 SERS 미세유체 칩 개발

탄저균의 주요 병원성인자인 PGA를 신속하고 정확하게 분석하기 위해서는 정확한 시료의 제어와 검출과정이 매우 중요하다. 본 연구에서는 PGA를 자동화 방식으로 제어하고 검출할 수 있는 듀얼 채널 미세유체칩(dual channel microfluidic chip)을 고안하여 제작하였다. Figure 4는 본 연구에 사용된 미세유체칩의 구조와 검출방법을 개략적으로 보여주고 있다. 이 칩은 두 개의 평행한 채널부로 구성되는데, PGA 센싱을 위한 센싱 채널과 대조군 측정을 위한 컨트롤 채널이다. SERS 기술을 이용한 바이오 분석법은 기존의 면역분석법보다 고감도의 정량분석을 수행할 수 있다는 장점은 있으나 나노입자 hot junction의 불균일성으로 인한 재현성이 문제이며 이를 해결하기 위한 효과적인 방법이 필요하다.
이 문제를 해결하기 위하여 각 측정 때마다 달라질 수 있는 라만 시그널의 세기를 보정할 수 있는 컨트롤 채널을 추가로 제작하였다. 즉, 센싱 채널은 다양한 PGA 농도를 가지는 시료의 라만 시그널 세기를 검출하고, 컨트롤 채널은 외부 표준으로 PGA가 없는 시료(PGA-free serum)의 라만 세기를 측정하여 매 측정시 그 값을 보정한다. 두 개의 채널은 모두 수직 방향으로 배열하여 설계하였고, 센싱 채널의 주입구에서는 PGA 항원을 포함하는 serum, 항PGA 항체가 고정화된 자성입자가 두 개의 주입구를 통해 채널 속으로 주입된다. 그 다음 PGA가 고정화된 금 나노프로브(AuNPs)가 미세유체칩의 중앙부에 위치한 주입구를 통해 채널 속으로 주입된다. 여기서, PGA 항원 및 PGA가 고정화된 금 나노프로브가 최적의 유체 흐름 조건 하에서 자성입자에 고정된 항체와 경쟁 면역반응을 일으킨다. 흐르는 유체 조건하에 효과적으로 면역복합체를 이룬 자성입자를 포획하기 위하여 두 개의 요크형 미니 솔레노이드 (전기장을 통한 자석)를 각 채널의 말단 부에 설치하였다. 즉, PGA 항원과 PGA가 고정화된 금 나노입자는 자성 비드에 붙어있는 PGA 항체에 경쟁적으로 결합하여 자성 면역복합체를 형성하고, 이 복합체는 말단에 배치된 전자석에 의하여 포획된다. 이 때 각 microfluidic 채널에 레이저를 조사하여 SERS 시그널을 측정하였으며, 측정된 면역복합체의 SERS 시그널은 동일한 방법으로 측정된 컨트롤 채널의 시그널을 보정하여 재현성을 증진하였다.
Figure 5에 미세유체칩의 채널 위치에 따른 센싱 채널과 컨트롤 채널의 SERS 시그널 변화를 나타내었다. 가장 위의 센싱 채널과 컨트롤 채널에서는 자성입자와 PGA serum만 혼합되었으므로 SERS 시그널이 관측되지 않았고, 중간 부분에서는 PGA가 고정화 된 금 나노입자가 주입되어 두 채널 모두 강한 SERS 시그널을 나타낸다. 이후에 자성 비드, 금 나노입자, PGA serum 등은 미세채널을 통과하면서 경쟁면역 반응에 의하여 복합체를 형성하는데, 가장 아랫부분에서 전자기장에 의하여 면역복합체가 포획된다. 이때, 센싱 채널의 경우에는 serum내의 PGA가 금 나노입자보다 우선적으로 자성 비드에 결합하므로 포획된 자성입자는 강한 SERS 시그널을 나타내지 않는 반면, 컨트롤 채널에서는 반대로 serum내에 PGA가 존재하지 않으므로 금 나노입자가 자성입자에 자유롭게 결합하여 금 나노입자-자성 비드 복합체를 구성하므로 강한 SERS 시그널을 나타내는 것을 볼 수 있다.

Figure 6는 서로 다른 PGA 농도에 대한 자성 면역복합체의 SERS 스펙트럼을 측정한 결과이다. 여기서, 1612 cm-1 라만피크의 세기가 PGA의 정량에 이용되었는데, Figure 6B에서 보는 바와 같이 PGA의 농도가 증가할수록 라만 피크세기는 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 이 때 100 pg/mL – 100 μg/mL의 PGA 농도 범위에서 R2=0.96의 직선 상관계수가 얻어졌다. 서론에서 언급한 바와 같이 SERS 기반 에세이에서 가장 중요한 이슈 중 하나는 재현성의 증진이다. 왜냐하면, 시그널의 측정과정에서 레이저 파워, 입자 크기의 균일성, 레이저에 의한 국부 가열, 미세한 반응시간 등의 실험적 환경 요소들이 작용하여 측정 재현성을 감소시킬 수 있기 때문이다. 본 연구에서는 이러한 재현성에 영향을 미치는 외부 환경요소의 영향을 최소화하기 위하여 매번 컨트롤 채널에서 PGA-free 시료에 대한 SERS 시그널을 측정하여 외부 표준값 (external standard)을 결정하였으며, 이를 센싱 채널에서 측정한 면역복합체의 SERS 시그널 값을 보정하는데 활용함으로써 측정 재현성을 크게 증진시킬 수 있었다. Figure 6B에서 윗부분의 점선으로 나타낸 그래프가 외부 표준값의 변화이며, 이를 보정한 센싱 채널의 PGA 농도변화에 따른 라만 피크세기의 변화를 Figure 6C에 나타내었다. 이 때, 직선 상관계수는 0.96에서 0.99로 크게 증진됨을 알 수 있다. 또한, 측정된 표준편차로부터 결정된 검출한계(LOD) 값은 100 pg/mL이며, 이는 앞에서 기술한 ELISA의 검출한계 결과보다 1,000 배 정도 증진된 값이다.
생물학적 무기로 사용 될 수 있는 탄저균과 같은 유해물질을 신속하게 현장에서 검출하기 위해서는 휴대가 가능한 바이오 광센서 시스템이 필요하다. 앞에서 언급한 바와 같이 라만 분광법의 경우 금속 나노입자와 미세유체칩을 이용하여 시료를 안전하게 제어하여 고감도로 측정할 수 있기 때문에 현장 적용성이 뛰어난 광센서 기술로 평가된다[13,14]. Figure 7에 시료를 자동으로 주입할 수 있는 lateral flow chip이나 미세유체칩을 광센서 시스템에 접목한 통합형 라만시스템의 사진을 나타내었다. 특히, 본 연구에서 제작된 미세유체칩은 시료의 자동제어와 고감도 측정이 가능하고, 정량적인 측정 재현성을 증진시킬 수 있기 때문에 다양한 응용이 기대된다.


III. 맺는 말

본 연구에서는 가장 강력한 생물학 무기 중 하나인 탄저균의 주요 병원성인자인 PGA를 마이크로 채널 내에서 제어하여 측정할 수 있는 미체유체칩을 제작하였으며, 금속 나노입자를 이용한 경쟁 면역 분석법과 표면증강라만분광 기술을 이용하여 이를 고감도로 검출할 수 있는 신 개념의 면역 분석 기술을 소개하였다. 혈액 내에 존재하는 탄저균 바이오마커 PGA의 농도를 정확하게 정량분석하기 위하여 금속 나노입자가 결합된 자성 비드를 선택적으로 포획할 수 있는 자성 솔레노이드 장비를 칩 내에 장착하였으며, 포획된 면역 복합체의 고감도 라만 시그널을 측정하여 PGA를 분석하였다. 측정된 SERS 시그널에 대한 신뢰도롤 향상시키기 위하여 PGA-free serum의 표준라만 시그널을 측정할 수 있는 컨트롤 채널을 제작하여 보정하였다. 그 결과 아주 좋은 신뢰성을 가지는 검량곡선을 획득할 수 있었으며, 100 pg/mL의 PGA 검출한계를 얻어 기존의 ELISA 면역분석방법보다 1,000 배 정도의 고감도 검출이 가능함을 보였다. 또한, 미세유체칩 기술을 소형 라만분광기와 결합한 통합형 라만 광센서 시스템을 개발하면, 현장에서 유해물질을 빠르고 안전하게 탐지할 수 있는 신기술로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.


Ⅳ. 참고문헌

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본 원고는 Biosensors & Bioelectronics 2015, 72, 230-236 과 Bull. Korean Chem. Soc. 2015, 36, 822-826에 게재된 논문들을 재편집하여 작성하였습니다.
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