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2013-2019년 국내 백일해 분리균주의 유전형 및 독소유전자 분석
  • 작성일2019-07-11
  • 최종수정일2019-07-11
  • 담당부서세균분석과
  • 연락처043-719-8110
  • 667

2013-2019년 국내 백일해 분리균주의 유전형 및 독소유전자 분석


질병관리본부 감염병분석센터 세균분석과
김소현, 이진, 정상운, 유재일, 황규잠*


*교신저자 : kyuhwang61@korea.kr, 043-719-8110


Abstract


Genotypic analysis of antigenic determinant genes and the toxin gene of Bordetella pertussis strains isolated in Korea, 2013-2019


Kim Sohyeon, Lee Jin, Jung Sang Oun, Yoo Jaeil, Hwang Kyuhjam
Division of Bacterial Diseases, Center for Laboratory Control of Infectious Disease, KCDC


Whooping cough (or pertussis), caused by Bordetella pertussis infection, is a respiratory disease that is most severe in infants who are too young to be vaccinated or not yet completely vaccinated. Although vaccination was introduced in the 1950s, pertussis has remained an endemic disease. Moreover, epidemic outbreaks are reported periodically every 3 to 5 years in several countries despite their high vaccine coverages (e.g., in Australia, Netherlands, United Kingdom, and United States). In Korea, the incidence of pertussis has been on the increase since 2009, with 980 cases reported in 2018. One of the reasons for the increasing number of  pertussis cases is that the current strains have different genotypes than vaccine strain, with stronger promotors in pertussis toxin gene, resulting in toxin production. Therefore, we determined the multilocus sequence typing (MLST) genotypes and toxin gene promotor types in 61 B. pertussis strains isolated in Korea, 2013 to 2019. The major MLST genotype detected in the antigenic determinant genes was ST2, with 2 new minor genotypes also detected (ST9 and ST10). ST2 was different from the vaccine type and it was maintained as the major type prior to 2013. In these Korean isolates, a low level of allelic variation was observed only in the ptxS1, prn, and Fim3 genes. All strains tested in this study showed the ptxP3 genotype, which is associated with greater toxin production. In conclusion, we confirmed that the currently circulated B. pertussis strains show different genotypes from  the vaccine strain and have strong pertussis toxin gene promotors. In addition, the prevalence of a new variant type, recently reported in the pertactin gene, should be confirmed in future studies.


Keywords: Bordetella pertussis, Genotype, Multilocus sequence typing, Pertussis toxin promotor, Incidence, Prevalence



  들어가는 말


백일해는 Bordetella pertussis 세균의 감염에 의해 발생되는 호흡기감염병으로 백신으로 예방 및 관리가 가능한 질병이지만 백신 접종이 완전하지 않은 영유아에게서는 매우 심각한 증상을 유발한다[1]. 주요 증상은 콧물, 재채기, 미열, 기침 등의 가벼운 감기증상을 시작하여 발작성 기침이 연속적으로 발생하는 병증 최고조의 시기를 지나 장기간 기침이 동반되는 회복기를 거치게 된다. 주요 합병증으로는 세균성 폐렴, 흉골 골절, 호흡곤란, 발작, 뇌증 등으로 심할 경우 사망할 수도 있다[2].
1950년대 백신 도입 이후 전 세계적으로 백일해 발생률이 크게 감소하였으나, 최근 연구에 따르면 백신 접종률이 높은 국가에서도 대규모 백일해 유행이 반복되고 있는 것으로 보고되고 있고 이러한 양상은 점차 증가하고 있다[3]. 특히 백신 접종률이 높은 국가에서 보고되는 발병 증가 사례의 특징은 백신접종이 완료되지 않은 신생아에서보다 백신접종이 완료된 청소년과 성인층에서의 발병 비율이 점차 증가하는 것으로 그 원인이 현재까지 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 우리나라에서 백일해백신은 필수 예방 접종제로서 95% 이상의 기본접종 완료율이 보고되고 있으나, 2009년부터 청소년과 성인에서 백일해 발생 비율이 2.2%(2001~2008년 평균)에서 49.1%(2009~2018년 평균)로 크게 증가한 실정이다.
백일해 예방백신의 접종률이 높음에도 환자 발생이 증가하는 원인으로 현재 성분백신(Acellular vaccine)이 다양한 유형의 백일해 유행균주들 방어에 한계가 있고, 기존 백신의 방어영역을 벗어나는 감염력이 높은 변이균주가 유행하면 백신접종에 의해 획득된 면역력이 연령 증가에 따라 감소되고 백일해 감염 대상이 청소년 및 성인층으로 확대되어 전파력이 강한 감염원의 pool이 증가함에 따른 것 등이 보고되고 있다. 여러 가지 추정 원인 중 유행균주의 유전형 변이에 따른 현상이라는 것과 항체가 감소가 주요 발병 증가 원인으로 인정되고 있으며 이에 대한 연구가 지속되고  있다[4]. 특히 항원결정기와 관련된 유전자 중 백신성분과 관련한 중요 유전자는 ptxS1, Fim2, Fim3, FHA, prn, TcfA 등이 있고 이러한 유전형의 분포는 각 나라별로 유행 시기에 따라, 다른 유전형 분포를 나타내는 것으로 보고되었다. 2009년, 2012년 국내 발병 증가 시기에 분리된 균주 역시 기존 분리균주 유형과 다른 새로운 유전형을 가진 균주의 비율이 증가되는 것으로 확인되었다[5].
이 글에서는 국내 유행 백일해균주의 유전형 및 독소형을 주기적으로 파악하고자 2013년부터 2019년 상반기까지 국내에서 분리된 백일해 균주를 대상으로 multilocus sequence typing(MLST) 기법을 이용한 유전형 분석과 독소 프로모터 유전자인 ptxP allele type의 분석을 실시하였고 그 결과를 공유하고자 한다.



  몸 말


2013년부터 2019년까지 백일해 의심환자의 호흡기 검체에서 분리되어 수집된 백일해 균주 61주에 대하여 MLST 분석을 실시하였고, 분석 유전자는 기존 연구에서 사용한 7개의 house keeping 유전자인 GlyA, Adk, Icd, TyrB, PepA, Pgm, FumC와 10개의 항원결정기 유전자인 ptxS1, prn, FHA, Fim2, Fim3, OmpQ, BapC, CyaA, Vag8, TcfA 그리고 백일해 독소 프로모터(ptxP) 유전자를 대상으로 하였다.
각 유전자별로 PCR primer와 반응조건에 따라 증폭한 후 염기서열을 분석하였고 분석된 염기서열은 B. pertussis MLST database로부터 내려 받은 각 유전자별 allele type의 염기서열과 다중정렬(multiple alignment) 방식으로 정렬하여 분리균주의 allele type을 결정하였다. Database에 등록되지 않은 유전자들의 allele type은 NCBI의 GenBank에서 각 allele type에 대한 sequence를 내려 받아 분석대상 유전자와 다중정렬한 후 비교하여 분석하였다.



MLST 기법을 이용한 유전형 분석 결과, 최근 국내 분리균주의 house keeping 유전자의 경우는 분석된 7종의 유전자에서 모두 단일한 유전형들이 확인되었다. 항원결정기 유전자의 경우에도 house keeping 유전자와 유사하게 큰 변화는 확인되지 않았다. PtxS1(type 1,2), prn(type 1,2), Fim3(type 1,2)에서만 2종류 유전형이 확인되었고, 나머지 7종의 항원결정기 유전자의 유전형은 모두 단일 유전형들로 확인되었다. 2013년부터 2019년 분리균주의 sequence type(ST)분포를 확인한 결과, house keeping 유전자의 경우에는 모든 균주가 ST2(1,1,1,3,1,1,1)형으로 확인되었다. 항원결정기 유전자의 경우, ST2, ST3, ST9, ST10의 4가지 유형의 ST가 확인되었으며 이중 ST2(1,2,1,1,1,2,1,2,2,2) 유형의 빈도가 90.1%로 가장 높았다. 또한 prn 유전자 allele type이 type 1로 확인된 ST3(1,1,1,1,1,2,1,2,2,2) 유형도 확인되었으며 특히 국내 분리균주 중 새로운 유형 ST9(2,2,1,1,1,2,1,2,2,2)와 ST10(1,2,1,1,2,2,1,2,2,2)이 낮은 빈도로(2015년 2주, 2017년 1주, 2018년 1주) 확인되었다. ST9(3.3%)의 경우는 PtxS1 유전자가 allele type 2로 분석되어 분석대상 균주들이 allele type 1을 나타내는 것과는 차이가 있었고 ST10(3.3%)의 경우는 Fim3 유전자가 allele type 2로 분석되어 분석대상 균주들이 allele type 1을 나타내는 것과는 차이가 있었다.




백일해 독소(pertussis toxin)의 발현을 조절하는 독소유전자 프로모터 영역에서의 변이가 보고되었는데, 현재까지 11개의 변이형(ptxP1~ptxP11)이 보고되고 있다[6,7]. 이러한 변이형 중 ptxP3형은 백일해 독소의 생성을 1.5~1.8배 정도 증가시키는 것으로 보고되었다. 본 연구에서도 백일해 독소프로모터(ptxP) 변이형 확인을 위하여 독소유전자 프로모터 부분의 약 550bp 영역을 PCR로 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 확인된 각 균주별 염기서열은 기존에 GenBank에 보고된 ptxP1~ptxP11 type의 염기서열을 내려 받아 다중정렬 방식에 따라 비교하여 각각의 유형을 판정하였다. 분석결과 2013년 이후에 분리된 균주들은 모두 독소 생성이 증가된 ptxP3 유형으로 확인되었다.



  맺는말


백일해는 백신 접종에 의해 전 세계적으로 발병률은 크게 감소하였지만, 미국, 네덜란드, 호주, 영국 등 세계 각국에서 2~3년을 주기로 하는 일시적 발병 증가 양상이 보고되었고, 국내에서도 2009년 이후 지속적인 소규모 유행이 보고되고 있다. 따라서 질병관리본부 세균분석과에서는 1999년 이후 국내 백일해 환자로부터 분리된 임상분리균주에 대한 유전형변이 여부를 지속적으로 분석하여 보고하고 있다.
본 연구에서 확인된 house keeping 유전자의 경우는 모든 균주가 MLST ST2 유형으로 2000년 이후 변화가 없는 것으로 확인되었다. 항원결정기 유전자의 경우는 백신주와는 다른 ST2 유형이 주된 유형으로 분포하였고, 최근 분리균주 집단에서 신규 MLST 유형이 낮은 빈도지만 2015년 분리균주에서 ST9 유형, 2017년~2018년 분리균주에서 ST10 유형이 신규로 확인되었다. 따라서 국내 분리균주에서도 미국이나 일본, 네덜란드와 마찬가지로 주로 항원결정기 유전자에서만 유전형 변이가 확인되고 있고, 항원결정기 유전자의 경우에도 ptxS1, prn, Fim3 유전자와 관련된 유전형 변이가 확인되었다. 또한 백일해 독소(pertussis toxin)의 생산량을 증가시켜 백일해의 감염 및 전파를 촉진하는 것으로 알려진 ptxP 유전자 변이 확인 결과 최근 분리균주에서는 모두 ptxP3 유형이 단일 유형으로 확인되었다.
이러한 결과로 미루어볼 때, 국내에 분포하고 있는 백일해균은 지속적인 변화 양상을 나타내고 있는 것으로 추정된다. 다만 분리균주 수가 보고되는 발생건수에 비하여 낮은 비율로 수집됨에 따라 연도별 균주유형 분석에 한계점이 있다. 따라서 더 많은 균주가 수집되어 분석될 수 있도록 유전자 검사 양성으로 확인된 검체에 대한 배양검사를 실시할 수 있도록 하고, 배양검사에 적합한 세균용 수송배지를 사용할 수 있도록 지속적인 홍보가 필요할 것이다. 이와 함께 최근에 보고되고 있는 pertactin 결손주에 대한 분포 여부에 대해서도 추가 분석에 대한 검토가 필요할 것으로 사료된다. 결론적으로 이러한 MLST 유전형 등 국내 백일해 분리균주에 대해 확인된 다양한 유전형 database는 국내 유행 백일해 균주유형의 변이 추세 예측 등 백일해 관리 정책 검토에 있어 유용한 기초자료로 제공될 수 있을 것이다.



  참고문헌


1. Valerie B, Julien G, et al. Genomic Sequencing of Bordetella pertussis for Epidemiology and Global Surveillance of Whooping Cough. Emer Inf Dis. 2018;24(6):988-994.
2. Mattoo S, Cherry JD. Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetella pertussis and other Bordetella subspecies. Clin Microb Rev. 2005;18(2):326-382.
3. Winter K, Harriman K, et al. California pertussis epidemic. 2010. J Pediatr. 2012;161:1091-1096.
4. Packard ER, Parton R, Coote JG, Fry NK. Sequence variation and conservation in virulence -related genes of Bordetella pertussis isolates from the UK. J Med Microb. 2004;53(5):355-365.
5. Sang-Oun Jung, Yu Mi Moon, So-Hyeon Kim, et al. Multilocus sequence analysis of housekeeping genes and antigenic determinant genes in Bordetella pertussis strains isolated in Korea. Osong Public Health Res Perspect. 2011;2:115-126.
6. Frits RM, Inge HM van Loo, Marjolein van Gent, et al. Bordetella pertussis strains with increased toxin production associated with pertussis resurgence. Emer Inf Dis. 2009;15(8):1206-1213.
7. 김소현, 정상운. 국내 백일해 분리균주에서 확인된 백일해 독소 프로모터(ptxP) 영역의 변이 현황. 주간 건강과 질병. 2012;5(36):673-676.

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